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Espectrofotometria de absorção no UV-VisívelA espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria. A palavra espectro de origem grega foi empregada para nomear raios luminosos em virtude de na antiguidade as pessoas sepultarem seus mortos em covas rasas, e o simples fato de alguém desavisado pisar em cima, de uma dessas sepulturas fazia com que o gás metano fosse expelido, visto que corpos em decomposição liberam diversos gases, entre eles o metano, que apresenta uma propriedade de auto inflamar-se apresentando um aspecto luminoso intenso. Quando alguém era surpreendido por uma bola gasosa dessa ficava assustado e dizia estar sendo assustado por um fantasma que em grego é espectro. Fundamento da espectrofotometriaA luz de uma maneira geral é mais bem descrita como sendo uma radiação eletromagnética em virtude de sua natureza dualística. Ou seja, ela existe e tem um comportamento de campos elétricos e magnéticos oscilantes como a figura abaixo representa: Onde: O comprimento de onda (λ) é distancia em metros, de um pico ao outro da onda; A frequência (v) é o grau de oscilação das ondas, em função da velocidade da luz no vácuo que é representada pela constante c (c=2, 998x108m. s-1). De modo que: λ . v = c Espectro eletromagnético representando os comprimentos de onda correspondente a cada radiaçãoA técnica espectroscópica é baseada na no aumento de energia em função do aumento da frequência da radiação incidida. Quando uma espécie química absorve energia na forma de fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre uma transição de um orbital de mais baixa energia para outro de maior energia. Um exemplo disso são compostos químicos que apresentam duplas ligações C=C no benzeno e C=O, a carbonila, por exemplo. Benzeno As cetonas da ligação peptídica O aumento de energia é representado pela condição de frequência de Bohr: E = hv Onde: E é a energia que aumenta em função da frequência, e h é a constante de Planck h=6,626x10-34J.s. A transição eletrônica de duplas ligações, ocorre em virtude de uma ligação dupla ser formada por um orbital sigma (σ) e um orbital (π), de modo que o elétron que está no orbital pi ligante vai para o orbital pi antiligante que tem maior energia. (para detalhes maiores vide teoria do orbital molecular). A transição nas C=C é na C=O é representada na figura abaixo, essa espécies químicas são denominadas cromóforos ou substâncias que trazem a cor: Para C=C : π-π* Para C=O : (orbital não-ligante) n-π* Aminoácidos como a Fenilalanina, Tirosina e Triptofano são os principais responsáveis pela absorção de luz das proteínas em virtude de possuírem o anel benzênico em sua estrutura química, além da ligação peptídica listada acima. A luz é absorvida na faixa de 280nm. Lei de Lambert-BeerA “força vital” da espectrofotometria está fundamentada na lei de Lambert-Beer, que estabelece:
Ou: Onde : Os componentes principais de um espectrofotômetro são apresentados e suas respectivas funções: Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e uma lâmpada de tungstênio (semelhante à lâmpada de carro). A lâmpada de deutério emite radiação UV e a de tungstênio emite luz visível. Monocromador: alguns espectrofotômetros ainda possuem um prisma como monocromador, porém os mais modernos possuem dispositivos eletrônicos que transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda, em um só comprimento, ou seja, a luz monocromática. Cubetas utilizadas em espectrofotometria. Geralmente usa-se cubeta de 1 cm, a fim de facilitar os cálculos da Lei de Lambert-Beer. Cubeta: é o recipiente propício para conter a amostra que será utilizada na análise, as cubetas podem ser de quartzo, vidro e acrílico, porém recomenda-se que seja usada uma cubeta de quartzo por que o vidro e o plástico absorvem UV e causa a reflexão da luz visível. Detector: o detector é um dispositivo que detecta a fração de luz que passou pela amostra e transfere para o visor e para o computador acoplado ao aparelho. Análise espectrofotométricaPasso 1: a amostra deve ser preparada com a quebra da amostra por métodos mecânicos, químicos ou físicos; Passo 2: a amostra é solubilizada no solvente escolhido em um balão volumétrico limpo e seco; IMPORTANTE: o solvente na maioria das vezes é água, porém, quando tratar-se de amostras apolares que precisam ser diluídas em solvente orgânico nunca utilize alcenos, alcinos, cetonas ou qualquer outro que tenha ligações C=C ou C=O ou triplas. Passo 3: em uma cubeta é colocado o solvente puro e lido no comprimento de onda o mesmo que será lida a amostra, esse procedimento é chamado leitura em branco, e tem como finalidade minimizar os erros causados, pela absorção luz ocasionados pelo vidro e pela água; Passo 4: a amostra é filtrada em uma membrana de 0,2 μm, por que a solução deve estar totalmente límpida a fim de diminuir ao máximo o erro causado por partículas em suspensão, a cubeta contendo o branco e retirado do equipamento e sua absorção anotada. Após esse processo a solução de interesse é lida, e dessa absorbância é subtraído a leitura do branco. Cuidados em espectrofotometria
Bibilografia: Lenhinger, Albert Lester; Princípios de Bioquímica.3.ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro:1992. cp.3. Fundamentos de Química Analítica - West, Donald M.; Holler, F. James; Skoog, Douglas A. Jones, Loretta; Atkins, Peter Princípios de Química - Questionando a Vida Moderna e o Meio Ambiente - 3 ª Ed-Porto Alegre:Bookman, 2006. Texto originalmente publicado em https://www.infoescola.com/quimica/espectrofotometria/ Quanto mais concentrada for a solução maior será a sua absorbância?Quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz. Por outro lado, a cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida.
Como medir a absorbância?Por exemplo, para converter 56% de T em absorbância, calcule 2 - log (56) = 0,252 unidades de absorbância. Para converter um valor de absorbância em porcentagem de transmitância, use a seguinte equação:% T = antilog (2 - absorbância).
Como calcular a absorbância de uma solução?Ela é dada pela equação A = log10(l0/l). A intensidade deve ser obtida com o uso de um espectrofotômetro. A absortividade de uma solução varia de acordo com a frequência da onda que passa por ela.
Quanto maior a absorbância?Ao passo que a absorbância de uma solução aumenta, a transmitância diminui. Quanto maior a camada que a luz irá incidir sobre, maior é a absorbância. Ou seja, a transmissão de luz decresce com o aumento linear da espessura da camada. Então, quanto maior a espessura da camada, maior a absorbância.
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